ANÁLISES DOS PIGMENTOS DAS SEMENTES DE URUCUM
Amostragem de sementes de urucum
Para que um resultado analítico possa ser extrapolado para um lote de sementes de urucum, a amostra enviada para a análise deve representar esse lote. Como a quantidade de sementes enviada ao laboratório geralmente é muito pequena quando comparada com todo o lote a ser avaliado, a amostragem deve ser cuidadosamente realizada. Além disso, como já foi discutido nessa publicação, os pigmentos do urucum estão presentes no pericarpo da semente e essa característica torna a concentração desses pigmentos especialmente sensível a uma série de fatores como a degradação pela exposição à luz, a degradação pela reação com o oxigênio da atmosfera e a perda pelo atrito entre as sementes ou com a embalagem. Tudo isso torna o processo de amostragem de sementes de urucum um desafio que deve ser enfrentado com técnicas e ferramentas adequadas.
Dificilmente se consegue a homogeneidade em um lote de sementes e o que se busca é que a amostra seja a mais representativa possível. Quando o lote a ser analisado é pequeno, o processo de amostragem é mais simples, mas nem por isso deve ser negligenciado. Uma amostra representativa de um pé de urucum não pode ser atribuída às sementes contidas nas cachopas de um único ramo. Por exemplo, a incidência solar sobre o ramo amostrado pode afetar a média da concentração de bixina daquela árvore. O ideal é que a amostragem seja proveniente de diversas partes da árvore.
A amostragem de grandes lotes é muito mais complexa e deve ser realizada de forma que a quantidade amostrada represente o valor médio de todo o lote. Uma das formas mais utilizadas é a amostragem simples em diversos pontos do lote, seguida pela homogeneização dessa amostra (formando uma amostra composta) e subamostragens para o envio ao laboratório (amostra de trabalho). Nesse momento é interessante a separação de uma duplicata (amostra testemunha). A amostra testemunha (armazenada em condições adequadas) poderá servir como referência para qualquer problema que houver na execução dos ensaios e na interpretação dos dados analíticos.
A manipulação das amostras, a embalagem utilizada para o transporte até o laboratório e a forma de armazenamento das amostras de sementes (ou corantes) de urucum tem influência direta na qualidade do resultado analítico. A amostragem faz parte do processo analítico apesar de dificilmente estar sob o controle do pessoal do laboratório.
A facilidade com que os pigmentos do urucum se desprendem das sementes torna o processo de manipulação dessas sementes um dos pontos críticos da amostragem. Deve-se ter o cuidado de manipular as sementes de forma que perca o mínimo de pigmento. Sementes com alta umidade (> 15%), além de propiciar o crescimento de fungos, facilita a perda do pigmento pelo contato com qualquer superfície, enquanto que sementes com baixa umidade (< 5%) perde o pigmento pelo simples atrito entre as sementes. O ideal é trabalhar com sementes com umidade próxima a 10% e manipulá-las o mínimo possível.
A embalagem usada para o transporte das sementes ao laboratório deve ser adequada para esse tipo de amostra. Os carotenóides são pigmentos sensíveis à degradação pela luz e pelo oxigênio e recomenda-se usar embalagens que minimizem esses problemas.
Método analítico
Apesar de ser relativamente simples, a determinação de bixina (carotenóides totais expressos como bixina) em sementes de urucum por espectrofotometria, deve ser realizada por pessoal qualificado para isso. O método é baseado na extração dos pigmentos das sementes com uma solução alcalina de óleo de mamona (óleo de rícino) à quente, diluição do extrato e leitura em espectrofotômetro a 453 nm. A quantificação dos pigmentos é feita com o uso de um fator denominado “coeficiente de absorção” . Leia mais sobre coeficiente de absorção aqui.
Metodologia
Materiais
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Erlemeyer de 300 mL.
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Pipeta de pasteur.
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Barra magnetica (“peixinho” para agitador magnético)
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Espátulas.
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Pipetas volumétricas de 5 mL e 10 mL
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Balões volumétricos de 50 mL e 100 mL.
Equipamentos
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Balança semi-analítica.
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Agitador magnético.
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Espectrofotômetro UV/VIS.
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Chapa de aquecimento.
Reagentes
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Óleo de mamona puro (óleo de rícino).
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Hidróxido de potássio p.a.
Soluções
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Solução de hidróxido de potássio 45%. Pesar 45 g de hidróxido de potássio p.a. e diluir para 100 mL com água deionizada.
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Solução de hidróxido de potássio 0,5%. Pesar 0,5 g de hidróxido de potássio p.a. e diluir para 100 mL com água deionizada.
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Solução de óleo de mamona (“Solução sabão”). Misturar 290 mL de óleo de mamona com 100 mL de hidróxido de potássio 45% e 190 mL de água deionizada. Aquecer em chapa de aquecimento, pré aquecida a 300ºC até a ebulição. Deixar em ebulição por 5 minutos agitando ocasionalmente. (Obs. A solução passará de opaca para uma solução clara).
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“Solução sabão” de trabalho. Misturar 50 mL de solução sabão, 130 mL de solução de hidróxido de potássio 45% e 1L de água deionizada. Essa será a solução utilizada no procedimento analítico.
Procedimento analítico
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Pesar e anotar o peso do erlenmeyer de 300mLvazio;
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Pesar 10g ± 2g de sementes de urucum inteiras no erlemeyer de 300 mL. Anotar o peso do erlemeyer com as sementes.
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Adicionar 60 mL de “solução sabão” de trabalho e aquecer em chapa de aquecimento até ebulição agitando o erlenmeyer ocasionalmente. Manter em ebulição por cerca de um minuto.
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Esfriar a temperatura ambiente.
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Pesar o erlenmeyer com o extrato e as sementes. Descontar o peso do erlenmeyer vazio e corrigir a massa para cerca de 260 g utilizando água destilada. Anotar a massa final. (Essa massa, subtraída da massa das sementes, será utilizada como valor da primeira diluição).
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Agitar em agitador magnético por 10 minutos.
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Transferir uma alíquota de 10 mL para balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com solução de hidróxido de potássio 0,5%. Agitar bem.
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Rediluir 5 mL da solução anterior para um balão de 50mL com solução de hidróxido de potássio 0,5% e agitar bem.
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Realizar leitura no espectrofotômetro à 453 nm. Utilizar solução de Hidróxido de Potássio 0,5% como referência ou para zerar o equipamento. Se necessário, realizar outra diluição para a leitura da absorbância fique entre 0,3 e 0,7.
Cálculos
(1) Carotenóides totais expressos como bixina.
Referência
SILVA, M.G. Análises de pigmentos em sementes de urucum. In: I REUNIÃO NACIONAL DA CADEIA PRODUTIVA DO URUCUM, Campinas. Anais... Campinas: ITAL, 2007. p. 79-83.
CARVALHO, P.R.N.; SILVA, M.G.; MOREIRA, C.G. Avaliação dos métodos espectrofotométricos de análise de sementes de urucum (Bixa orellana L.). Coletânea do ITAL, Campinas, v. 23, n. 2, p.181-188, jul./dez.1993.
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Problemas dos métodos de análises
Significado da incerteza
Como interpretar o laudo
Apesar de muito utilizado o método espectrofotométrico para análise de bixina em sementes de urucum é muito questionado. Conheça os principais problemas envolvendo as análises de bixina em sementes de urucum.
Todo resultado analítico traz uma incerteza em seu valor. Esses desvios é decorrente de pequenas incertezas que acompanham cada passo do ensaio e geralmente é representado pelo desvio padrão.
Um laudo analítico apresenta uma série de informações que devem ser cuidadosamente avaliada por quem o recebe. Saber interpretar esse laudo é muito importante.
Expressão dos resultados das análises de pigmentos do urucum por métodos espectrofotométricos
Um aspecto importante na quantificação dos carotenóides do urucum por espectrofotometria diz respeito à expressão dos resultados. Os processos analíticos que usam soluções alcalinas como KOH ou NaOH na extração e quantificação dos pigmentos, têm como resultado a concentração dos carotenoides totais expressos como sal de norbixina e devem ser adequadamente convertidos para que sejam expressos como bixina ou norbixina. Isso pode ser feito utilizando as massas moleculares de cada uma dessas substâncias.