ANÁLISES DE PIGMENTOS DAS SEMENTES DE URUCUM
Problemas observados nas análises de pigmentos de sementes de urucum
A grande importância dos corantes derivados das sementes de urucum nas indústrias de alimentos têm gerado uma série de trabalhos científicos que utilizam desde técnicas analíticas simples como a espectrofotometria no comprimento de onda visível até sistemas sofisticados como a cromatografia líquida de alta eficiência com detectores de arranjo de diodos e espectrometria de massas. Apesar de já existirem procedimentos analíticos que permitem a separação, a identificação e a quantificação dos vários pigmentos presentes nas sementes de urucum utilizando técnicas cromatográficas, os procedimentos mais simples como a espectrofotometria tem sido a base de muitos artigos científicos e, principalmente, o método analítico mais utilizado no controle de qualidade e no comércio dos corantes e das sementes de urucum.
A espectrofotometria é uma técnica analítica que mede a concentração de substâncias por meio da absorção da luz pelas moléculas em uma solução. Quando um feixe de luz monocromática (Io) incide sobre uma solução, parte da luz é absorvida e a outra parte passa pela solução (I). A quantidade de luz absorvida depende da concentração das moléculas na solução e do percurso óptico ou seja: a espessura do suporte onde a solução está sendo contida (l). Quanto mais moléculas absorventes estiverem na solução, maior será absorção de luz.
A quantificação de soluções por espectrofotometria geralmente é baseada na construção de curvas-padrão que relaciona a concentração de uma substância absorvente com sua absorção em um determinado comprimento de onda.
Para a construção desses gráficos são utilizados padrões analíticos da substância de interesse. O problema é que a bixina e a norbixina como todos os carotenóides [1] são extremamente lábeis e a manutenção de padrões analíticos confiáveis é bastante questionável. Por isso o grande artifício tem sido lançar mão do coeficiente de absorção, também conhecido como coeficiente de extinção ou absorbância específica desses pigmentos. O coeficiente de absorção pode ser definido como a absorbância de uma solução com 1% de moléculas absorvente (no nosso caso bixina, norbixina ou o sal sódico ou potássico da norbixina) em um caminho óptico de 1cm a um determinado comprimento de onda.
A importância desses coeficientes de absorção é tanta que prolifera na literatura um grande número desses fatores para os mais diferentes solventes e comprimentos de ondas e, em alguns casos, com valores diferentes para uma mesma condição analítica.
Há uma discussão generalizada sobre a validade de alguns dos coeficientes de absorção mais utilizados para as análises de bixina, norbixina e seus sais. Esses questionamentos têm sido caracterizados pela ausência de confirmação científica dos argumentos apresentados. Raros são os trabalhos que indicam a forma como esses coeficientes de absorção foram estabelecidos e mais raros ainda os artigos que indicam a precisão desses valores.
Esses valores são inversamente proporcionais aos resultados analíticos, ou seja, um coeficiente de absorção superestimado sempre acarretará um resultado analítico (concentração de pigmentos) subestimado.
Como exemplo podemos utilizar os valores já apresentados pela FAO (Food and Agriculture Organization) ao longo do tempo. Em 1975 a FAO publicou o Nutricion Meeting Report Nº 54 onde apresentou para análises de extratos aquosos de urucum, expressos em norbixina, um [E 1% 1cm] igual a 2850 para leituras em um comprimento de onda de 453nm em solução aquosa de NaOH 0,1N. Em 1982 a própria FAO alterou esse valor para 3473 a um comprimento de onda de 453nm em solução aquosa de NaOH 0,01N (Food and Nutrition Paper Nº 25). Esse valor foi alterado novamente pela FAO em 2006 para a análise de extratos de urucum extraídos com soluções alcalinas, citando um coeficiente de absorção igual a 2870 a um comprimento de onda de 482nm em solução de KOH 0,5%. (FAO JECFA Monographs Nº 3).
O analista que não se atentar para essas alterações pode estar usando coeficientes de absorção desatualizados (alterados pela FAO) e apresentando resultados totalmente distintos de outros laboratórios que utilizam os valores mais recentes.
Uma mesma amostra, utilizando esses diferentes valores, apresentaria os seguintes resultados:
Essa diferença de resultados confunde os profissionais da área e demonstra a importância de se uniformizar os valores dos coeficientes de absorção utilizados pelos laboratórios que realizam esses ensaios.
Outro grande equívoco que muitos laboratórios cometem está na apresentação dos resultados analíticos. A maior parte das análises espectrofotométrica dos pigmentos das sementes ou dos corantes de urucum é realizada sem uma separação dos pigmentos presentes na amostra. Quando se extrai os pigmentos das sementes de urucum com soluções aquosas alcalinas (NaOH ou KOH) ou com solventes orgânicos como acetona ou clorofórmio, vários outros carotenóides presentes são coextraídos. Esses pigmentos geralmente absorvem em comprimentos de ondas muito próximos aos da bixina ou da norbixina e na leitura espectrofotométrica potencializam a absortividade medida. Mesmo considerando que a maior parte desses pigmentos seja representada pela bixina ou pela norbixina, o que se está medindo são todos os carotenóides presentes nessas soluções. Como geralmente é utilizado o coeficiente de absorção específico para bixina ou para norbixina, se não houver uma prévia separação desses pigmentos, o correto é apresentar os resultados como “carotenóides totais expressos em bixina (ou norbixina)”.
[1] Os carotenóides formam uma classe de pigmentos naturais onde a bixina e a norbixina está inserida. Eles são caracterizados por conterem em suas moléculas um grande número de duplas ligações conjugadas que lhes conferem cores que vão do vermelho ao amarelo.
O que significa a incerteza que acompanha o resultado analítico
Quase todo resultado de uma análise química trás embutido uma incerteza. Essa incerteza deve ser expressa no laudo analítico e geralmente vem logo depois do resultado da análise e é apresentado entre parênteses ( ) ou antecedido de uma notação de “mais ou menos” (±). Por exemplo: uma análise de bixina em sementes de urucum cujo resultado foi 4,0 gramas de bixina por 100 gramas de semente (ou 4%) e cuja incerteza foi de 0,2 g/100 g (ou 0,2%) deveria ser expressa das seguintes formas: Bixina = 4,0 g/100 g (0,2 g/100 g) ou 4,0 g/100 g ± 0,2 g/100 g.
Mas o que isso significa?
No processo analítico, ou seja, durante a realização da análise, várias etapas são necessárias. Por exemplo: na determinação da concentração de pigmentos em uma amostra de sementes de urucum é necessário de pesar certa quantidade de sementes, adicionar um determinado volume de solvente para extrair os pigmentos, separar as sementes do solvente, realizar quantas diluições forem necessárias para a leitura da cor e finalmente “ler” a cor no espectrofotômetro. Cada uma dessas etapas pode conter pequenos “erros” que juntos representam um valor que deve ser considerado no resultado final da análise. Por isso cada resultado expresso em um laudo geralmente é uma média de algumas repetições analíticas da mesma amostra.
Geralmente as repetições analíticas apresentam resultados um pouco diferentes. Vamos voltar ao nosso exemplo de análise de bixina em sementes de urucum. Vamos também supor que o resultado da análise de nossa amostra de sementes de urucum foi obtido por meio de três repetições analíticas (ou seja, o procedimento analítico foi integralmente repetido três vezes para a mesma amostra). Essas três análises deram como resultados os seguintes valores de bixina por 100 g de sementes: primeira análise = 3,8 g, segunda análise = 4,0 g e terceira análise = 4,2 g. Se calcularmos a média dos três resultados teremos uma concentração média igual a 4,0 g/100 g de semente. Mas só esse valor não nos informa que houve uma variação nas análises e que as sementes analisadas podem ter desde 3,8 g /100 g até 4,2 g/100 g. Por isso existe a necessidade de também expressar a incerteza do resultado, ou seja, nossa amostra tem 4,0 g de bixina por 100 g de semente com uma incerteza de 0,2 g/100 g.
Em alguns casos essa incerteza é expressa como desvio padrão ou estimativa de desvio padrão. O desvio padrão é uma forma estatística de expressar a incerteza.
Como interpretar um relatório de ensaio
Para discutir aspectos importantes que devem estar contido em um documento desse tipo vamos utilizar um modelo de Relatório de Ensaio dos laboratórios no Instituto de Tecnologia de Alimentos (ITAL - Campinas - SP) emitido para uma amostra de corante de urucum. Cada item está apontado em vemelho na figura acima:
A = Identificação do Relatório. Essa identificação deve ser única de forma a facilitar o rastreamento aos dados brutos do ensaio.
B = Identificação da pessoa/empresa que solicitou o ensaio.
C = Identificação da solicitação do ensaio. Essa identificação facilita a rastreabilidade ao pedido de análises de forma a garantir que tudo o que foi acordado está sendo apresentado no relatório.
D = Endereço da pessoa/empresa que solicitou o ensaio.
E = Data do recebimento da amostra no laboratório.
F = Data do início da análise. Essa informação é importante para o conhecimento do período que a amostra ficou sob a guarda do laboratório até que sua análise fosse iniciada. Na solicitação do ensaio é importante informar como ela deve ser armazenada.
G = Data de emissão do Relatório de Análise.
H = Tipo de ensaios foram realizados.
I = Descrição da amostra. Essa descrição geralmente é fornecida pelo interessado e serve para identificar a amostra que está sendo analisada.
J = Citação da documentação da metodologia utilizada para a análise, seguida da referência bibliográfica do método original.
K = Apresentação dos resultados dos ensaios realizados, geralmente na forma de uma Tabela.
L = Identificação do ensaio realizado.
M = Apresentação do resultado analítico seguida da informação da precisão desse valor (veja texto ao lado). Esses dados devem ser sucedidos ou precedidos da unidade em que foram expressos (ex. g/100g; mg/100g; ppm; etc).
N = Observações sobre os resultado analítico. Essas observações geralmente apresenta informações importantes sobre o resultado analítico.
O = Observações gerais sobre o Relatório de Ensaio.
P e Q = Identificação dos responsáveis pela análise e pela liberação do Relatório de Ensaio.
Expressão dos resultados das análises de pigmentos do urucum por métodos espectrofotométricos.
Um aspecto importante na quantificação dos carotenóides do urucum por espectrofotometria diz respeito à expressão dos resultados. Os processos analíticos que usam soluções alcalinas como KOH ou NaOH na extração e quantificação dos pigmentos, têm como resultado a concentração dos carotenoides totais expressos como sal de norbixina e devem ser adequadamente convertidos para que sejam expressos como bixina ou norbixina. Isso pode ser feito utilizando as massas moleculares de cada uma dessas substâncias.
Utilizando esses valores podemos estabelecer os seguintes fatores de conversão:
Portanto quando se utiliza na análise dos pigmentos das sementes de urucum uma solução do KOH (Hidróxido de Potássio) o resultado da leitura espectrofotométrica corresponde, preponderantemente, ao sal de potássio da norbixina, que tem massa molecular de 456,66 g. Assim, para que o resultado analítico seja expresso em bixina há a necessidade de conversão desse valor utilizando suas massas moleculares ou os fatores de conversão apresentados anteriormente.
Coeficientes de absorção de bixina e norbixina
Absortividade da norbixina