ESTUDO INTERLABORATORIAL DE ANÁLISE DE SEMENTES DE URUCUM

Preparo e validação do material de referência

Amostras de sementes de urucum

1. Amostragem

          Uma amostra de 5 kg sementes de urucum da “variedade” Piave, da safra de 2016, armazenada sob vácuo, foi obtida de junto a uma empresa de corantes localizada no Estado de São Paulo. A amostra foi previamente limpa com a retirada parcial de impureza por catação manual. Em seguida a amostra foi homogeneizada e subamostrada em parcelas de aproximadamente 50g. Essas subamostras foram envasadas sob vácuo em uma embalagem de filme laminado a base de poliéster, alumínio e polipropileno, com taxa de permeabilidade ao oxigênio inferior a 0,005mL/m2/dia. As amostras foram identificadas com a seguinte codificação: EI-U0717-NN,onde NN é uma numeração seqüencial que identifica cada amostra individualmente.

                    Para os ensaios de validação da amostra foram separados ao acaso as seguintes embalagens: 7, 12, 25, 28. 39, 47, 56, 68, 71 e 76. A embalagem 55 foi utilizada para o estudo de homogeneidade intra-embalagem.

 

2. Validação das amostras

          Para avaliação estatística da homogeneidade quanto aos carotenóides totais expressos como bixina ou norbixina foi realizada a análise de variância de resultados analíticos obtidos de ensaios em duplicatas, independentes e simultâneas, das dez amostras e de cinco repetições analíticas da mesma embalagem.

          Foi estabelecido como aceitável, para o estudo de homogeneidade entre as embalagens de sementes de urucum usadas como referência, o coeficiente de variação menor ou igual a duas vezes o coeficiente de variação obtido pela equação de HORWITZ[1]. Para a avaliação de valores discrepantes (outliers) os resultados foram avaliados pelo teste de Dixon e a distribuição normal dos valores encontrados foi avaliada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov.

 

3 Metodologia analítica

3.1 Objetivo

          Determinação de carotenóides totais expressos como bixina ou norbixina, em sementes de urucum. 

 

3.2 Princípio do método

         O método analítico baseia-se na saponificação da bixina em sal de norbixina com solução alcalina de óleo de mamona, diluição em solução de hidróxido de potássio e detecção e quantificação espectrofotométrica utilizando o coeficiente de absorção da norbixina.

 

3.3 Materiais

  • Erlemeyer de 300 mL.

  • Barra magnetica (“peixinho” para agitador magnético).

  • Espátulas.

  • Pipetas volumétricas de 1 mL ou pipetador.

  • Balões volumétricos de 10 mL e 100 mL.

 

3.4 Equipamentos

  • Balança semi-analítica.

  • Agitador magnético.

  • Espectrofotômetro UV/VIS.

  • Chapa de aquecimento.

  

3.5 Reagente

  • Óleo de mamona puro (óleo de rícino).

  • Hidróxido de potássio p.a.

 

3.6 Soluções

  • Solução de hidróxido de potássio 45%. Pesar 45 g de hidróxido de potássio p.a. e diluir para 100 mL com água deionizada.

  • Solução de hidróxido de potássio 0,5%. Pesar 5 g de hidróxido de potássio p.a. e diluir para 1000 mL com água deionizada.

  • Solução de óleo de mamona (“Solução de extração  - estoque”). Misturar 300 mL de óleo de mamona com 100 mL de hidróxido de potássio 45% e 200 mL de água deionizada. Aquecer em chapa de aquecimento até a ebulição. Deixar em ebulição por 5 minutos agitando ocasionalmente. (Obs. A solução passará de opaca para uma solução clara). Após isso retirar da chapa e deixar resfriar naturalmente.

  • “Solução de extração - trabalho”. Misturar 50 mL de solução de extração – estoque com 150 mL de solução de hidróxido de potássio 45% e completar para 1L com água deionizada. Essa será a solução utilizada no procedimento analítico.

 

3.7 Procedimento analítico

          Pesar e anotar a massa do erlenmeyer de 300 mL vazio. Transferir 10g ± 2g de sementes de urucum inteiras para erlemeyer de 300 mL e anotar a massa do erlemeyer com as sementes (Massa A). Adicionar 60 mL da “solução de extração - trabalho” e aquecer em chapa de aquecimento até ebulição agitando o erlenmeyer ocasionalmente. Manter em ebulição por cerca de um minuto. Esfriar a temperatura ambiente. Adicionar água destilada ao extrato até que a massa seja aproximadamente o valor da Massa A + 250g. Anotar a massa final. (Essa massa, subtraída da Massa A, será utilizada como valor da primeira diluição). Agitar em agitador magnético por 10 minutos. Transferir uma alíquota de 1,0 mL para balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com solução de hidróxido de potássio 0,5%. Agitar bem. Rediluir 1 mL da solução anterior para um balão de 10mL com solução de hidróxido de potássio 0,5% e agitar bem. Realizar leitura da última diluição no espectrofotômetro à 453 nm, utilizando a solução de hidróxido de potássio 0,5% como referência. Se necessário, realizar outra diluição para que a leitura da absorbância fique entre 0,3 e 0,7 unidades de absorbância.

3.8 Cálculos

          Utilizar a equação apresentada a seguir para calcular a concentração de carotenóides totais expressos como norbixina.

onde:

C = Concentração de carotenóides totais expressos como norbixina (g/100g);

A = Absorbância da amostra;

D = Diluição da amostra (ex: 100ml → 1mL : 25mL → D = 2.500;

m = massa da amostra (g).

= Coeficiente de absorção (2850 " para norbixina em solução aquosa de KOH a 453nm);

          Para converter o resultado para carotenóides totais, expressos como bixina, o valor deve ser dividido por 1,16.

4. Resultados

          Os resultados das análises de carotenóides totais nas amostras de sementes de urucum utilizadas como referência estão apresentados nas Tabelas 1 e 2.

TABELA 1. Resultados das análises de carotenóides totais expressos como norbixina e bixina  em uma das embalagens de sementes de urucum utilizadas nesse estudo. Resultados de cinco determinações simultâneas e independentes em amostras de uma mesma embalagem.

          Como a amostragem de sementes de urucum apresenta dificuldade de homogeneidade, estabelecemos como incerteza aceitável a estimativa de desvio padrão igual ou inferior a duas vezes o coeficiente de variação estabelecido pela equação de HORWITZ para a concentração carotenoides totais expressos como bixina ou norbixina obtida nesse estudo (Tabela 5),ou seja:

 

          - carotenoides totais expressos como norbixina → s ≤ 0,30 g/100g;

          - carotenoides totais expressos como bixina → s ≤ 0,27 g/100g;

 

          Os resultados dentro das mesmas embalagens apresentaram estimativa de desvio padrão inferior ao calculado pela equação de HORWITZ (carotenoides totais expressos como norbixina → s = 0,23; carotenoides totais expressos como bixina → s = 0,19). Portanto as amostras de referência de sementes de urucum foram consideradas homogêneas dentro das embalagens, para a determinação de carotenóides totais expressos como norbixina e/ou bixina.

TABELA 2. Resultados das análises de carotenoides totais expressos como norbixina e bixina nas embalagens de sementes de urucum utilizadas nesse estudo. Resultados é média aritmética de duas determinações simultâneas e independentes em amostras de dez embalagens escolhidas ao acaso.

          O teste de Kolmogorov-Smirnov indicou que os resultados das análises das amostras estão normalmente distribuídos e o teste de Dixon indicou que não há outlier entre esses valores. A Tabela 3 apresenta as análises de variância dos resultados de carotenoides totais expressos como norbixina (a) e bixina (b) para as amostras das embalagens de sementes utilizadas nesse estudo.

TABELA 3. Análise de variância dos resultados obtidos para a concentração de carotenoides totais expressos como norbixina (a) e bixina (b) entre as embalagens de sementes utilizadas nesse estudo.

As Análises de Variância indicaram que, para o nível de significância de 5%, não há evidências de diferenças significativas na concentração de carotenóides totais expressos como norbixina ou como bixina entre as embalagens de sementes de urucum e entre as repetições analíticas realizadas. Portanto as amostras foram consideradas homogêneas para a determinação de carotenoides totais expressos como norbixina ou como bixina nas embalagens de sementes de urucum utilizadas como referência.

[1] HORWITZ, W. Evaluation of analytical methods used for regulation of foods and drugs. Analytical Chemists,  v. 54, n. 1, p. 67A  – 76ª, 1982.

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