URUCUM

1 Objetivo

 

Determinar o teor Tocotrienois em sementes e produtos de urucum.

 

1.1 Princípio do método

 

O método baseia-se na diluição da amostra em n-hexano, detecção e quantificação com uso de HPLC-Detetor de fluorescência.

 

2 Aplicação

​

Aplica-se a amostras de sementes e produtos de urucum.

​

3 Método

​

3.1  Padrão e material de referência

 

Tocotrienois (isolados de óleo de palma, em laboratório):

• DL-a-tocotrienol

• DL-b-tocotrienol

• DL-g-tocotrienol

• DL-d-tocotrienol

• Isolamento dos tocotrienóis: realizar várias injeções do óleo de palma dissolvido em n-hexano e filtrado em membrana de 0,45mm nas condições descritas nos itens 4.3 e 4.5, coletar as frações de cada isoforma em frasco separados, secar o solvente sob fluxo de nitrogênio e dissolver o resíduo em volume conhecido de n-hexano. Secar alíquota de cada isoforma sob fluxo de nitrogênio, dissolver o resíduo em etanol 95% e homogeneizar, por cerca de um minuto, em agitador de tubos. Realizar leitura em espectrofotômetro (as absorbâncias devem ficar entre 0,3 e 0,7) e determinar a concentração do isômero como descrito no item 4.7.1.1. Preparar uma solução de trabalho com as quatros formas de tocotrienóis com concentrações por mL de solução próximas a 1,2 mg para a-tocotrienol, 2,4 mg para b tocotrienol, 2,1 mg para g-tocotrienol e 2,0 mg para d-tocotrienol. A partir da solução com as quatro formas de tocotrienóis, retirar alíquota de 0,55 mL e diluir para 5 mL com n-hexano para injetar no HPLC. A preparação da solução para injeção no HPLC deve ser diária. A cada 15 dias, injetar o padrão no HPLC com uso do detector de UV para verificar possível degradação e a injeção deve ocorrer na mesma condição de análise quantitativa, com troca apenas do detector, e uso de comprimento de onda de 292 nm.

 

3.2  Equipamentos

 

• Balança analítica

• Espectrofotômetro UV-VIS

• Pipetas volumétricas

• Agitador de tubos

• Banho com ultrassom

• Bomba de vácuo

• Tocotrienóis – HPLC acoplado ao detector de fluorescência com comprimentos de onda de excitação de 294 nm e emissão de 326 nm; coluna de sílica com dimensões de 250x4 mm, 5 mm

• Tocotrienóis, análise preparativa para isolamento dos tocotrienóis – HPLC acoplado ao detector de UV com monitoramento no comprimento de onda de 292 nm e coluna de sílica com dimensões de 250x4 mm, 5 mm.

 

3.3  Materiais

 

• Espátula

• Pipeta de pasteur

• Balão volumétrico de 1000, 50, 25, 10 mL

• Sistema de filtração para fase móvel munido com kitassato de 2000 mL, e porta membrana de 47 mm de diâmetro

• Sistema de filtração para amostra munido de seringa de 5 mL, e porta filtro para membrana de 13 mm de diâmetro

• Tubo de ensaio de 5 mL com tampa e boa vedação

• Membrana de celulose regenerada com poro de 0,45 mm, com diâmetro de 13 e 47 mm

• Cubetas de quartzo

 

3.4  Soluções e reagentes

 

• n-hexano para cromatografia

• Acetato de etila para cromatografia

• Ácido acético p.a.

• BHT (butilhidroxitolueno)

• Fase móvel analítica para tocotrienois - n-hexano:acetato de etila:ácido acético (97,6:1,8:0,6, v/v/v). Em balão volumétrico de 1000 mL colocar 18 mL de acetato de etila, 6 mL de ácido acético glacial e completar o volume com n-hexano. Filtrar em membrana de celulose regenerada com poro de 0,45 mm e diâmetro de 47 mm, retirar os gases dissolvidos com uso de banho com ultrassom e bomba de vácuo por 5 minutos. Utilizar vazão de 1,5 mL por minuto.

• Fase móvel preparativa para isolamento dos tocotrienóis – n-hexano:acetato de etila:ácido acético (97,3:1,8:0,9, v/v/v). Em balão volumétrico de 1000 mL colocar 18 mL de acetato de etila, 9 mL de ácido acético glacial e completar o volume com n-hexano. Filtrar em membrana de celulose regenerada com poro de 0,45 mm e diâmetro de 47 mm, retirar os gases dissolvidos com uso de banho com ultrassom e bomba de vácuo por 5 minutos. Utilizar vazão de 1,5 mL por minuto.

 

4  Procedimento

 

4.1 Fração insaponificável do óleo de urucum

 

• Pesar entre 0,02 e 0,07 g de amostra em balão volumétrico de 10 mL, completar o volume com n-hexano.

• Homogeneizar em agitador de tubos por um minuto.

• Filtrar a amostra em membrana de celulose regenerada com poro de 0,45 mm e diâmetro de 13 mm, recolher a amostra em tubo de ensaio com cerca de 5 mL com boa vedação.

• Injetar no HPLC.

• Fazer diluições necessárias para os isômeros ficarem com áreas próximas ao do padrão.

 

4.2 Sementes de urucum

 

• Pesar quantidade conveniente de amostra em balão de 250 mL com boca esmerilhada; adicionar 0,50 g de ácido ascórbico, 50 mL de etanol 95% e 20 mL da solução de hidróxido de potássio 50%;

• Colocar as amostras em banho-maria entre 80°C - 900C, acoplados a condensadores e deixar saponificar por aproximadamente 30 minutos, com injeção de nitrogênio na amostra;

• Lavar os condensadores com 20 mL de etanol 95%;

• Esfriar em banho-maria;

• Transferir o extato para funil de separação com auxílio de água, adicionar 120 mL de éter etílico, agitar por aproximadamente 2 minutos;

• Aguardar separar as fases, retirar a amostra para nova extração e colocar o éter etílico em um erlenmeyer;

• Repetir o processo de extração com 120 mL de éter etílico;

• Juntar as frações de éter etílico;

• Lavar a fração de éter etílico com:

• 100 mL da solução de cloreto de sódio 10%;

• água destilada;

• 100 mL da solução de etanol 10%;

• água destilada.

• Lavar com água destilada até pH neutro, testar a água de lavagem com solução de fenolftaleína 1%.

• Passar o extrato por sulfato de sódio anidro e recolher em balão de 250 mL com boca esmerilhada, adicionar um pequeno cristal de BHT. Lavar bem o sulfato com éter etílico.

• Concentrar o extrato em evaporador rotatório com temperatura máxima de 40°C, não deixar secar, ou sob fluxo de nitrogênio em banho-maria a 40°C.

• Transferir o extrato para tubo, lavar bem o balão com éter etílico, e evaporar o solvente até secura sob fluxo de N2.

• Retomar a amostra em 4 mL de n-hexano ou volume adequado e homogeneizar por aproximadamente 1 minuto no agitador de tubos.

• Filtrar a amostra em membrana com poro de 0,45 mm e diâmetro de 13 mm, recolher a amostra em tubo de ensaio com cerca de 5 mL e com boa vedação.

• Injetar no HPLC.

​

4.3 Correção da concentração das isoformas de tocotrienol

 

Leituras em Etanol 95%:

​

Analito                                 comprimento de ondas (nm)                     Coeficiente de absorção

​

alfa-tocotrienol                                     292                                                             86,0

Beta-tocotrienol                                    296                                                             86,2

Gama-tocotrienol                                 297                                                              91,0

Delta-tocotrienol                                   297                                                             85,8

​

5 Cálculos e expressão dos resultados

 

5.1 Cálculos

​

Concentração de cada isoforma do tocotrienol (mg/100g) 

​

Onde:

 

Cp = Concentração do padrão (injetado)

Aa = Área da amostra (cromatografia)

Ap = Área do padrão analítico (cromatografia)

mi = massa de amostra injetada

 

5.2 Expressão dos resultados

 

Expressar o resultado como mg de cada isoforma de tocotrienol por 100 g ou 100 mL de amostra.

​

6 Referências

 

EITNMILLER, R.; LEE, J. Vitamin E – Food Chemistry, Composition and Analysis. New York: Macel Dekker Inc., 2004.

​

FIRESTONE, D. (Ed.) Official Methods and Recommended Practices of the American Oil Chemists Society, 6th ed. 2nd Printing, Urbana: AOCS 2012. Met. CE 8-89, p. 1-6.

 

PANFILI, G.; FRATIANNI, A.; IRANO M. Normal phase high-performance liquid chromatography method for the determination of tocopherols and tocotrienols in cereals. Journal agriculture food chemistry., Washington, V. 51, P. 3940-3944, 2003.

​

​