CONTROLE DE QUALIDADE DAS SEMENTES DE URUCUM

 

Análise de geranilgeraniol em sementes e produtos de urucum

1  Objetivo

 

Determinar o teor de geranilgeraniol em sementes e produtos de urucum.

 

1.1 Princípio do método

 

O método baseia-se na extração do geranigeraniol com n-hexano, transferência para a fase móvel, detecção e quantificação por HPLC com detector de arranjo de diodos.

 

2 Aplicação

 

Aplica-se a produtos de urucum.

 

3 Método

 

3.1 Padrão analítico

 

  • Geranilgeraniol, mínimo 85%.

 

  • Preparo do padrão analítico: Diluir uma ampola com 100 mg de geranilgeraniol para 50 mL com metanol. Homogeneizar bem. Transferir o padrão para frasco âmbar com boa vedação. Transferir alíquota 0,5 mL para balão volumétrico de 50 mL (solução de trabalho).

 

3.2 Equipamentos

 

  • Balança analítica

  • Banho com ultrassom

  • Pipetas volumétricas

  • Bomba de vácuo

  • Banho Maria

  • Agitador de tubos

  • HPLC acoplado ao detector de conjunto de diodos com monitoração à 210 nm, coluna de fase reversa C18 com dimensões de 250 x 4 mm, 5 mm

 

3.3 Materiais

 

  • Balão volumétrico de 1000, 100, 50, 25, 10 mL

  • Pipeta de pasteur

  • Espátulas

  • Béquer

  • Espátulas

  • Provetas de 50 e 100 mL

  • Funil de separação de 250 e 500 mL

  • Funil

  • Balão volumétrico de 1000, 50, 25, 10 mL

  • Tubos com tampa com volume entre 20-25 mL e 70 mL

  • Filme plástico.

  • Sistema de filtração para fase móvel munido com kitassato de 2000 mL e porta membrana de 47 mm de diâmetro

  • Sistema de filtração para amostra munido de seringa de 5 mL e porta filtro para membrana de 13 mm de diâmetro

  • Tubos de ensaio com cerca de 5 mL com tampa e boa vedação

  • Membrana de celulose regenerada com poro de 0,45 µm com diâmetro de 13 e 47 mm

 

3.4 Soluções e reagentes

 

  • Metanol para cromatografia

  • n-hexano para cromatografia

  • Acetato de amônio p.a.

  • Solução de acetato de amônio 50 mM. Pesar 0,38 g de acetato de amônio e diluir para 100 mL com água deionizada.

  • BHT (butilhidroxitolueno)

  • Eter etílico p.a.

  • Solução aquosa de hidróxido de potássio 50% (m/v). Pesar 50,0 g de hidróxido de potássio, transferir para balão de 100 mL e completar o volume com água destilada.

  • Solução aquosa de cloreto de sódio 10% (m/v). Pesar 100 g de cloreto de sódio, transferir para balão volumétrico de 1000 mL e completar o volume com água destilada.

  • Solução aquosa etanólica 10% (v/v). Diluir 100 mL de etanol absoluto para 1000 mL com água destilada.

  • Solução etanólica de fenolftaleína 1% (m/v). Pesar 1,0 g de fenolftaleína e diluir para 100 mL com etanol 95%.

  • Solução etanólica de pirogalol 0,05% (m/v). Pesar cerca de 0,125 g de pirogalol e diluir para 250 mL com etanol 95% em balão volumétrico.

  • Solução extratora composta de éter etílico : éter de petróleo : acetato de etila [60:30:5 (v/v/v)]. Misturar 630 mL de éter de etílico, 315 mL de éter de petróleo e 50 mL de acetato de etila.

  • Fase móvel: metanol:acetato de amônio 50 mM (90:10, v/v). Transferir 100 mL de solução de acetato de amônio 50 mM para balão volumétrico de 1000 mL e completar o volume com metanol para cromatografia. Filtrar em membrana de celulose regenerada com poro de 0,45 µm e diâmetro de 47 mm, retirar os gases dissolvidos com uso de banho ultrassom e bomba de vácuo por 15 minutos. Utilizar vazão de 1,0 mL por minuto.

 

4 Execução do ensaio

 

4.1 Amostra da fração insaponificável da extração de corante de urucum.

 

  • Pesar ou pipetar entre 0,1g e 5g de amostra em béquer de 50 mL (a tomada de amostra depende da concentração esperada de geranilgeraniol)

  • Adicionar 25 mL de n-hexano.

  • Cobrir com filme plástico.

  • Colocar em banho com ultrassom por 10 minutos.

  • Filtrar em membrana de celulose regenerada de 0,45 mm.

  • Secar alíquota sob fluxo de nitrogênio e diluir na fase móvel.

  • Injetar no HPLC.

4.2 Sementes de urucum

 

  • Pesar entre 2g ± 1g de sementes em tubo com capacidade para cerca de 70 mL

  • Adicionar 20 mL de solução de etanólica de pirogalol e 10 mL de solução de KOH 50%. Agitar no agitador de tubos após cada adição.

  • Colocar as amostras em banho-maria entre 80°C - 90 °C e deixar saponificar por aproximadamente 30 minutos.

  • Esfriar em banho-maria.

  • Adicionar 20 mL de solução extratora e levar ao banho com ultrassom por cerca de 2 (dois) minutos.

  • Transferir a amostra para funil de separação, aguardar separar as fases, retirar a amostra para nova extração e colocar o solvente no erlenmeyer de 125 mL.

  • Repetir o processo de extração com 20 mL de solução extratora por mais 3 (três) vezes, como descrito acima.

  • Juntar as frações de solvente.

  • Lavar bem o erlenmeyer com a solução extratora e recolher no funil de separação.

  • Lavar a solução no funil de separação por 3 (três) vezes com 50ml de água destilada.

  • Lavar a solução no funil de separação com:

  • 50 mL da solução de cloreto de sódio 10%;

  • 2 (duas) vezes com 50ml de água destilada;

  • 50 mL da solução de etanol 10%;

  • 50 mL de água destilada.

  • Continuar a lavagem com água destilada até pH neutro, testar a água de lavagem com solução de fenolftaleína.

  • Após a amostra atingir pH neutro, retirar toda a água e recolher a amostra em tubo com cerca de 70 mL. Adicionar um pequeno cristal de BHT na amostra.

  • Colocar o tubo com a amostra em béquer com água com cerca de 40 °C. Concentrar a amostra sob fluxo de nitrogênio até secar.

  • Suspender a amostra em 4 mL de n-hexano e homogeneizar por aproximadamente 1 (um) minuto no agitador de tubos.

  • Filtrar a amostra em membrana com poro de 0,45 mm e diâmetro de 13 mm, recolher a amostra em tubo de ensaio com cerca de 5 mL e com boa vedação.

  • Injetar no HPLC

 

 

4.3 Curva analítica

 

  • A partir da solução de  trabalho do padrão de geranilgeranio (100mg/50mL → 0,5mL:50mL), retirar alíquotas de 0,3; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5mL, transferir para tubos, secar sob fluxo de nitrogênio e diluir na fase móvel.

  • Agitar no agitador de tubos por um minuto.

  • Filtrar em membrana de PTFE ou equivalente e recolher em tubo de ensaio.

  • Injetar no HPLC.

  • Traçar a curva de área x concentração e determinar a equação da reta.

5 Cálculos e expressão dos resultados

 

5.1 Cálculos

 

Concentração de geranilgeraniol (mg/100g) 

 

onde:

 

Cp = Concentração do padrão (injetado)

Aa = Área da amostra (cromatografia)

Ap = Área do padrão analítico (cromatografia)

mi = massa de amostra injetada

 

 

5.2 Expressão dos resultados

 

Expressar o resultado como mg ou g geranilgeraniol por 100 g ou 100 mL de amostra.

 

6 Referência

 

SILVA, M. G.; LUIZ, F. A.; ROCHA, F. W.; LEAL, R. N.; CARVALHO, P. R. N. Validação de método analítico de determinação de geranilgeraniol em sementes de urucum. In: 2° Reunião Nacional da Cadeia Produtiva do Urucum, Anais. Campinas, SP, 2010.

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Análise de geranilgeraniol em sementes e produtos de urucum

1 Objetivo

 

Determinar o teor Tocotrienois em sementes e produtos de urucum.

 

1.1 Princípio do método

 

O método baseia-se na diluição da amostra em n-hexano, detecção e quantificação com uso de HPLC-Detetor de fluorescência.

 

2 Aplicação

Aplica-se a amostras de sementes e produtos de urucum.

3 Método

3.1  Padrão e material de referência

 

Tocotrienois (isolados de óleo de palma, em laboratório):

  • DL-a-tocotrienol

  • DL-b-tocotrienol

  • DL-g-tocotrienol

  • DL-d-tocotrienol

  • Isolamento dos tocotrienóis: realizar várias injeções do óleo de palma dissolvido em n-hexano e filtrado em membrana de 0,45mm nas condições descritas nos itens 4.3 e 4.5, coletar as frações de cada isoforma em frasco separados, secar o solvente sob fluxo de nitrogênio e dissolver o resíduo em volume conhecido de n-hexano. Secar alíquota de cada isoforma sob fluxo de nitrogênio, dissolver o resíduo em etanol 95% e homogeneizar, por cerca de um minuto, em agitador de tubos. Realizar leitura em espectrofotômetro (as absorbâncias devem ficar entre 0,3 e 0,7) e determinar a concentração do isômero como descrito no item 4.7.1.1. Preparar uma solução de trabalho com as quatros formas de tocotrienóis com concentrações por mL de solução próximas a 1,2 mg para a-tocotrienol, 2,4 mg para b tocotrienol, 2,1 mg para g-tocotrienol e 2,0 mg para d-tocotrienol. A partir da solução com as quatro formas de tocotrienóis, retirar alíquota de 0,55 mL e diluir para 5 mL com n-hexano para injetar no HPLC. A preparação da solução para injeção no HPLC deve ser diária. A cada 15 dias, injetar o padrão no HPLC com uso do detector de UV para verificar possível degradação e a injeção deve ocorrer na mesma condição de análise quantitativa, com troca apenas do detector, e uso de comprimento de onda de 292 nm.

 

3.2  Equipamentos

 

  • Balança analítica

  • Espectrofotômetro UV-VIS

  • Pipetas volumétricas

  • Agitador de tubos

  • Banho com ultrassom

  • Bomba de vácuo

  • Tocotrienóis – HPLC acoplado ao detector de fluorescência com comprimentos de onda de excitação de 294 nm e emissão de 326 nm; coluna de sílica com dimensões de 250x4 mm, 5 mm

  • Tocotrienóis, análise preparativa para isolamento dos tocotrienóis – HPLC acoplado ao detector de UV com monitoramento no comprimento de onda de 292 nm e coluna de sílica com dimensões de 250x4 mm, 5 mm.

 

3.3  Materiais

 

  • Espátula

  • Pipeta de pasteur

  • Balão volumétrico de 1000, 50, 25, 10 mL

  • Sistema de filtração para fase móvel munido com kitassato de 2000 mL, e porta membrana de 47 mm de diâmetro

  • Sistema de filtração para amostra munido de seringa de 5 mL, e porta filtro para membrana de 13 mm de diâmetro

  • Tubo de ensaio de 5 mL com tampa e boa vedação

  • Membrana de celulose regenerada com poro de 0,45 mm, com diâmetro de 13 e 47 mm

  • Cubetas de quartzo

 

3.4  Soluções e reagentes

 

  • n-hexano para cromatografia

  • Acetato de etila para cromatografia

  • Ácido acético p.a.

  • BHT (butilhidroxitolueno)

  • Fase móvel analítica para tocotrienois - n-hexano:acetato de etila:ácido acético (97,6:1,8:0,6, v/v/v). Em balão volumétrico de 1000 mL colocar 18 mL de acetato de etila, 6 mL de ácido acético glacial e completar o volume com n-hexano. Filtrar em membrana de celulose regenerada com poro de 0,45 mm e diâmetro de 47 mm, retirar os gases dissolvidos com uso de banho com ultrassom e bomba de vácuo por 5 minutos. Utilizar vazão de 1,5 mL por minuto.

  • Fase móvel preparativa para isolamento dos tocotrienóis – n-hexano:acetato de etila:ácido acético (97,3:1,8:0,9, v/v/v). Em balão volumétrico de 1000 mL colocar 18 mL de acetato de etila, 9 mL de ácido acético glacial e completar o volume com n-hexano. Filtrar em membrana de celulose regenerada com poro de 0,45 mm e diâmetro de 47 mm, retirar os gases dissolvidos com uso de banho com ultrassom e bomba de vácuo por 5 minutos. Utilizar vazão de 1,5 mL por minuto.

 

4  Procedimento

 

4.1 Fração insaponificável do óleo de urucum

 

  • Pesar entre 0,02 e 0,07 g de amostra em balão volumétrico de 10 mL, completar o volume com n-hexano.

  • Homogeneizar em agitador de tubos por um minuto.

  • Filtrar a amostra em membrana de celulose regenerada com poro de 0,45 mm e diâmetro de 13 mm, recolher a amostra em tubo de ensaio com cerca de 5 mL com boa vedação.

  • Injetar no HPLC.

  • Fazer diluições necessárias para os isômeros ficarem com áreas próximas ao do padrão.

 

4.2 Sementes de urucum

 

  • Pesar quantidade conveniente de amostra em balão de 250 mL com boca esmerilhada; adicionar 0,50 g de ácido ascórbico, 50 mL de etanol 95% e 20 mL da solução de hidróxido de potássio 50%;

  • Colocar as amostras em banho-maria entre 80°C - 900C, acoplados a condensadores e deixar saponificar por aproximadamente 30 minutos, com injeção de nitrogênio na amostra;

  • Lavar os condensadores com 20 mL de etanol 95%;

  • Esfriar em banho-maria;

  • Transferir o extato para funil de separação com auxílio de água, adicionar 120 mL de éter etílico, agitar por aproximadamente 2 minutos;

  • Aguardar separar as fases, retirar a amostra para nova extração e colocar o éter etílico em um erlenmeyer;

  • Repetir o processo de extração com 120 mL de éter etílico;

  • Juntar as frações de éter etílico;

  • Lavar a fração de éter etílico com:

  • 100 mL da solução de cloreto de sódio 10%;

  • água destilada;

  • 100 mL da solução de etanol 10%;

  • água destilada.

  • Lavar com água destilada até pH neutro, testar a água de lavagem com solução de fenolftaleína 1%.

  • Passar o extrato por sulfato de sódio anidro e recolher em balão de 250 mL com boca esmerilhada, adicionar um pequeno cristal de BHT. Lavar bem o sulfato com éter etílico.

  • Concentrar o extrato em evaporador rotatório com temperatura máxima de 40°C, não deixar secar, ou sob fluxo de nitrogênio em banho-maria a 40°C.

  • Transferir o extrato para tubo, lavar bem o balão com éter etílico, e evaporar o solvente até secura sob fluxo de N2.

  • Retomar a amostra em 4 mL de n-hexano ou volume adequado e homogeneizar por aproximadamente 1 minuto no agitador de tubos.

  • Filtrar a amostra em membrana com poro de 0,45 mm e diâmetro de 13 mm, recolher a amostra em tubo de ensaio com cerca de 5 mL e com boa vedação.

  • Injetar no HPLC.

4.3 Correção da concentração das isoformas de tocotrienol

 

Leituras em Etanol 95%:

Analito                                 comprimento de ondas (nm)                     Coeficiente de absorção

alfa-tocotrienol                                     292                                                             86,0

Beta-tocotrienol                                    296                                                             86,2

Gama-tocotrienol                                 297                                                              91,0

Delta-tocotrienol                                   297                                                             85,8

5 Cálculos e expressão dos resultados

 

5.1 Cálculos

Concentração de cada isoforma do tocotrienol (mg/100g) 

Onde:

 

Cp = Concentração do padrão (injetado)

Aa = Área da amostra (cromatografia)

Ap = Área do padrão analítico (cromatografia)

mi = massa de amostra injetada

 

5.2 Expressão dos resultados

 

Expressar o resultado como mg de cada isoforma de tocotrienol por 100 g ou 100 mL de amostra.

6 Referências

 

EITNMILLER, R.; LEE, J. Vitamin E – Food Chemistry, Composition and Analysis. New York: Macel Dekker Inc., 2004.

FIRESTONE, D. (Ed.) Official Methods and Recommended Practices of the American Oil Chemists Society, 6th ed. 2nd Printing, Urbana: AOCS 2012. Met. CE 8-89, p. 1-6.

 

PANFILI, G.; FRATIANNI, A.; IRANO M. Normal phase high-performance liquid chromatography method for the determination of tocopherols and tocotrienols in cereals. Journal agriculture food chemistry., Washington, V. 51, P. 3940-3944, 2003.

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